BiFC技術服務

我們的技術優勢

? 活細胞內檢測：細胞生理狀態下直接觀察蛋白質相互作用，保留了時空動態信息。實驗結果更加直觀和易于理解。

? 高特異性：只有當目標蛋白相互作用時，熒光信號才會出現，減少了假陽性結果，提高了檢測的特異性。

? 高靈敏度：檢測弱或瞬時相互作用，對低親和力、短暫相互作用敏感，能夠揭示一些傳統方法難以檢測到的相互作用。

? 實驗經驗豐富：浦芥專注于植物細胞樣本分析

實驗流程

服務內容

服務說明

1. 浦芥的BiFC實驗只在煙草中進行驗證，默認設置1個實驗組和2個陰性對照組。判定實驗成功的標準：實驗組有熒光，而陰性對照無熒光。若實驗組檢測到熒光，說明兩個蛋白能夠互作，反之說明不互作。

2. 為保證煙草轉化效率，本公司不接受客戶提供的農桿菌。

3. 浦芥提供多組BiFC載體，方便選擇使用。載體選擇參見表 《浦芥生物BiFC可用載體列表》。

浦芥生物BiFC可用載體列表

4. 客戶如有特殊檢測要求，雙方協商具體服務事項。BiFC技術服務內容包括：基因克隆、載體構建與驗證、農桿菌轉化、煙草瞬時轉化、共聚焦顯微鏡觀察拍照。各項目可整體檢測也可單獨檢測。

5. 收費方式：后付費，零預收費啟動項目。BiFC實驗不成功僅收取載體構建費用。待項目完成數據交與客戶認可后，30日內開具發票，轉賬付費。

6. 結果確認。客戶收到本公司的結題報告后，請務必在7日內確認結果，如有問題及時反饋售后人員，到期如無異議，默認該項目成功。

7. 本合作僅限于為科研單位或個人提供BiFC技術服務，所交付的產物僅作為實驗室的研究材料使用，不具備商業用途，合作雙方應在國家相關法律法規允許的范圍內使用，違者對產生的后果自行負責，本公司不承擔任何連帶責任。

客戶提供材料

1. 待驗證互作蛋白的基因序列，名稱等注釋信息，如果特別要求請在備注中注明；

2. 如客戶提供載體，需提供載體MCS測序報告，如無測序報告則需另外收取測序費用，由本公司代為測序。質粒濃度為>100ng/μl，低溫運輸，需提供熒光蛋白的顏色或者激發光和發射光波長等信息；

反饋客戶結果

1. 客戶委托本公司構建載體，項目結束后提供構建好的載體及相關測序結果；

2. 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。默認1個實驗組拍3個視野，2個陰性對照組各拍1個視野，每個視野包含熒光蛋白、DIC、Merge共3張圖。

常見問題及解析（Q&A）

Q：如何確保BiFC實驗中檢測到的熒光信號反映的是真實的蛋白質相互作用？

A: 為了確保熒光信號的真實性，需要排除假陽性的可能性。假陽性可能是由于熒光蛋白片段的非特異性相互作用或其他非目標蛋白質之間的相互作用引起的。因此，在實驗中應設置對照組，如單獨表達熒光蛋白片段或目標蛋白的對照組，以排除非特異性相互作用的干擾。也可重復實驗，保持每次實驗條件（如細胞類型、培養條件、成像參數等）的一致性，比較蛋白質相互作用結果是否一致；此外，還可以結合其他實驗方法，如免疫共沉淀（Co-IP）、酵母雙雜交（Y2H）、GST pull-down和熒光素酶蛋白互補實驗（LCA）等，以多角度、多層次地驗證蛋白質相互作用的真實存在。

Q：BiFC結果無信號或信號弱可能的原因是什么？怎么解決？

A: 可能的原因有多種。首先，確認載體是否有問題，熒光蛋白選擇是否合適，融合蛋白設計有無缺陷，甚至可以對調N端和C端的目的基因。其次，有些基因表達時間長，在原生質體中表達不明顯，可以嘗試在煙草體系中表達，且適當調節觀察時間，以便觀察到更明顯的結果。同時，確定激光共聚焦顯微鏡觀察是否有失誤。此外，煙草狀態不佳也可導致農桿菌侵染效率低，蛋白表達弱，進而影響熒光信號。浦芥生物常年供應煙草活體苗，可聯系相關負責人15301627726索取。

針對無信號的情況解決方法有：① 建議優化、升級載體系統，并檢查融合蛋白的表達情況；② 優化、調整實驗體系，延長培養時間，增加菌液濃度，提高乙酰丁香酮用量。③ 在制片過程中，應徹底清理干凈葉片表面雜質，排除氣泡，以減少背景干擾。④ 適當調節觀察時間，分時段檢測（24h/48h/72h），弱表達蛋白需延長至96小時。?如果以上原因都已驗證排除，還是沒有熒光信號，可能是所研究的蛋白質之間確實不存在相互作用，因此無法形成完整的熒光蛋白。

Q：為什么有些基因預測互作且在酵母雙雜中顯示互作，但BiFC結果顯示無信號？

A: 由于在酵母雙雜實驗中BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，也可以單獨激活報告基因的表達，導致最后的實驗結果出現假陽性。有些重組還可能會破壞蛋白之間的互作，且不同外源基因的瞬時表達效率大不相同，建議在BiFC之前先做個亞細胞定位評價一下兩個基因的表達效率，以便調整兩個質粒的轉化條件。

Q：在煙草BiFC中什么樣的光才算有效光？

A: 在制片過程中時，盡可能清理干凈葉片表面的雜質，排除氣泡。看顯微鏡時，激發光電壓不能打得太高，初始功率設置為設備最大功率的 ?1-5%?（如50mW激光器使用0.5-2.5mW），逐步增加至最低有效信號強度?，煙草細胞的輪廓清晰可見，且分布均勻。

Q：一個蛋白的普通定位和兩個蛋白的BiFC定位結果不一致，一個在細胞質，另一個在細胞核？

A: 兩個蛋白的互作可能會影響其中一個蛋白的定位，比如，在文獻《Rice SPX6 negatively regulates the phosphate starvation response through suppression of the transcription factor PHR2》中，PHR2-mCherry定位在細胞核，Fig.5c 35S-SPX6-GFP和35S-PHR2-mCherry共轉定位在細胞核、細胞質，兩個蛋白的相互作用影響了單個蛋白的亞細胞定位位置。

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