BiFC技術(shù)服務(wù)
BiFC技術(shù)服務(wù)
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI)是細胞內(nèi)許多生物過程的基礎(chǔ)，如信號轉(zhuǎn)導、代謝調(diào)控、免疫應(yīng)答和基因轉(zhuǎn)錄翻譯等。研究蛋白質(zhì)間的相互作用對于闡明蛋白質(zhì)的生物功能以及分子作用機理具有重要的意義。
蛋白質(zhì)間相互作用研究的方法眾多，雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC) 是一種直觀、快速判斷目標蛋白在活細胞中的相互作用和定位的技術(shù)，因其直觀性使得 BiFC 技術(shù)迅速獲得應(yīng)用，已經(jīng)成為檢測活體細胞中蛋白質(zhì)相互作用的一種常規(guī)方法。
BiFC技術(shù)基于蛋白質(zhì)片段互補的原理，將熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開，形成兩個互補但各自不發(fā)熒光的 N-末端和 C-末端片段。將它們分別連接到待驗證互作的兩個蛋白質(zhì)A和B上，在細胞內(nèi)共表達這兩個融合蛋白時，由于蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B發(fā)生相互作用，熒光蛋白的兩個片段在空間上互相靠近互補，重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，從而產(chǎn)生熒光，通過熒光顯微鏡可直觀地觀察到蛋白質(zhì)間的相互作用。
我們的技術(shù)優(yōu)勢
? 活細胞內(nèi)檢測：細胞生理狀態(tài)下直接觀察蛋白質(zhì)相互作用，保留了時空動態(tài)信息。實驗結(jié)果更加直觀和易于理解。
? 高特異性：只有當目標蛋白相互作用時，熒光信號才會出現(xiàn)，減少了假陽性結(jié)果，提高了檢測的特異性。
? 高靈敏度：檢測弱或瞬時相互作用，對低親和力、短暫相互作用敏感，能夠揭示一些傳統(tǒng)方法難以檢測到的相互作用。
? 實驗經(jīng)驗豐富：浦芥專注于植物細胞樣本分析
實驗流程
服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)說明
1. 浦芥的BiFC實驗只在煙草中進行驗證，默認設(shè)置1個實驗組和2個陰性對照組。判定實驗成功的標準：實驗組有熒光，而陰性對照無熒光。若實驗組檢測到熒光，說明兩個蛋白能夠互作，反之說明不互作。
2. 為保證煙草轉(zhuǎn)化效率，本公司不接受客戶提供的農(nóng)桿菌。
3. 浦芥提供多組BiFC載體，方便選擇使用。載體選擇參見表 《浦芥生物BiFC可用載體列表》。
浦芥生物BiFC可用載體列表
4. 客戶如有特殊檢測要求，雙方協(xié)商具體服務(wù)事項。BiFC技術(shù)服務(wù)內(nèi)容包括：基因克隆、載體構(gòu)建與驗證、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、煙草瞬時轉(zhuǎn)化、共聚焦顯微鏡觀察拍照。各項目可整體檢測也可單獨檢測。
5. 收費方式：后付費，零預收費啟動項目。BiFC實驗不成功僅收取載體構(gòu)建費用。待項目完成數(shù)據(jù)交與客戶認可后，30日內(nèi)開具發(fā)票，轉(zhuǎn)賬付費。
6. 結(jié)果確認。客戶收到本公司的結(jié)題報告后，請務(wù)必在7日內(nèi)確認結(jié)果，如有問題及時反饋售后人員，到期如無異議，默認該項目成功。
7. 本合作僅限于為科研單位或個人提供BiFC技術(shù)服務(wù)，所交付的產(chǎn)物僅作為實驗室的研究材料使用，不具備商業(yè)用途，合作雙方應(yīng)在國家相關(guān)法律法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用，違者對產(chǎn)生的后果自行負責，本公司不承擔任何連帶責任。
客戶提供材料
1. 待驗證互作蛋白的基因序列，名稱等注釋信息，如果特別要求請在備注中注明；
2. 如客戶提供載體，需提供載體MCS測序報告，如無測序報告則需另外收取測序費用，由本公司代為測序。質(zhì)粒濃度為>100ng/μl，低溫運輸，需提供熒光蛋白的顏色或者激發(fā)光和發(fā)射光波長等信息；
3. 盡可能詳細的填寫“BiFC技術(shù)服務(wù)登記表”，發(fā)送至售前銷售的微信 15301627726 或郵箱 sales01@pujiebio.com；
反饋客戶結(jié)果
1. 客戶委托本公司構(gòu)建載體，項目結(jié)束后提供構(gòu)建好的載體及相關(guān)測序結(jié)果；
2. 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。默認1個實驗組拍3個視野，2個陰性對照組各拍1個視野，每個視野包含熒光蛋白、DIC、Merge共3張圖。
3. 提供包含詳細實驗步驟、分析整理圖片結(jié)果的結(jié)題報告，以及BiFC激光共聚焦原始圖片。《BiFC技術(shù)服務(wù)結(jié)題報告-模板》【注：此模板僅供參考】
案例展示
常見問題及解析（Q&A）
Q：如何確保BiFC實驗中檢測到的熒光信號反映的是真實的蛋白質(zhì)相互作用？
A: 為了確保熒光信號的真實性，需要排除假陽性的可能性。假陽性可能是由于熒光蛋白片段的非特異性相互作用或其他非目標蛋白質(zhì)之間的相互作用引起的。因此，在實驗中應(yīng)設(shè)置對照組，如單獨表達熒光蛋白片段或目標蛋白的對照組，以排除非特異性相互作用的干擾。也可重復實驗，保持每次實驗條件（如細胞類型、培養(yǎng)條件、成像參數(shù)等）的一致性，比較蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果是否一致；此外，還可以結(jié)合其他實驗方法，如免疫共沉淀（Co-IP）、酵母雙雜交（Y2H）、GST pull-down和熒光素酶蛋白互補實驗（LCA）等，以多角度、多層次地驗證蛋白質(zhì)相互作用的真實存在。
Q：BiFC結(jié)果無信號或信號弱可能的原因是什么？怎么解決？
A: 可能的原因有多種。首先，確認載體是否有問題，熒光蛋白選擇是否合適，融合蛋白設(shè)計有無缺陷，甚至可以對調(diào)N端和C端的目的基因。其次，有些基因表達時間長，在原生質(zhì)體中表達不明顯，可以嘗試在煙草體系中表達，且適當調(diào)節(jié)觀察時間，以便觀察到更明顯的結(jié)果。同時，確定激光共聚焦顯微鏡觀察是否有失誤。此外，煙草狀態(tài)不佳也可導致農(nóng)桿菌侵染效率低，蛋白表達弱，進而影響熒光信號。浦芥生物常年供應(yīng)煙草活體苗，可聯(lián)系相關(guān)負責人15301627726索取。
針對無信號的情況解決方法有：① 建議優(yōu)化、升級載體系統(tǒng)，并檢查融合蛋白的表達情況；② 優(yōu)化、調(diào)整實驗體系，延長培養(yǎng)時間，增加菌液濃度，提高乙酰丁香酮用量。③ 在制片過程中，應(yīng)徹底清理干凈葉片表面雜質(zhì)，排除氣泡，以減少背景干擾。④ 適當調(diào)節(jié)觀察時間，分時段檢測（24h/48h/72h），弱表達蛋白需延長至96小時。?如果以上原因都已驗證排除，還是沒有熒光信號，可能是所研究的蛋白質(zhì)之間確實不存在相互作用，因此無法形成完整的熒光蛋白。
Q：為什么有些基因預測互作且在酵母雙雜中顯示互作，但BiFC結(jié)果顯示無信號？
A: 由于在酵母雙雜實驗中BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合，也可以單獨激活報告基因的表達，導致最后的實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性。有些重組還可能會破壞蛋白之間的互作，且不同外源基因的瞬時表達效率大不相同，建議在BiFC之前先做個亞細胞定位評價一下兩個基因的表達效率，以便調(diào)整兩個質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化條件。
Q：在煙草BiFC中什么樣的光才算有效光？
A: 在制片過程中時，盡可能清理干凈葉片表面的雜質(zhì)，排除氣泡。看顯微鏡時，激發(fā)光電壓不能打得太高，初始功率設(shè)置為設(shè)備最大功率的 ?1-5%?（如50mW激光器使用0.5-2.5mW），逐步增加至最低有效信號強度?，煙草細胞的輪廓清晰可見，且分布均勻。
有效信號?必須嚴格匹配BiFC復合物重構(gòu)熒光蛋白的特征波長（如Venus-YFP的激發(fā)488nm/發(fā)射500-550nm）?。信噪比（SNR）≥3（ImageJ定量分析）。與陰性對照（單獨VN/VC片段）強度差異＞5倍?。有效信號必須呈現(xiàn)符合生物學邏輯的空間分布特征，比如膜蛋白應(yīng)在細胞邊緣形成連續(xù)輪廓，核蛋白則與DAPI共定位。真正的互作信號會在多次實驗中穩(wěn)定出現(xiàn)，且強度隨時間增強（熒光蛋白正確折疊需要時間），培養(yǎng)24-48小時觀察，與熒光蛋白成熟周期相符，若信號在12小時就強烈出現(xiàn)，反而可能是假陽性。無效信號特征?：熒光強度隨時間驟降（10分鐘內(nèi)＞50%），細胞形態(tài)變形（如液泡破裂）。Q：一個蛋白的普通定位和兩個蛋白的BiFC定位結(jié)果不一致，一個在細胞質(zhì)，另一個在細胞核？
A:
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